外泌體為何物?相信看過(guò)外泌體科普文的童鞋們都已經(jīng)很熟悉了，在此小編就不再贅述，這里主要針對(duì)外泌體的進(jìn)展及獲取兩方面談?wù)剛€(gè)人觀(guān)點(diǎn)。

　　在剛剛過(guò)去的2020年，盡管科學(xué)研究受疫情影響，但外泌體研究領(lǐng)域仍然取得了諸多進(jìn)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在基礎(chǔ)研究方面，2020年外泌體領(lǐng)域發(fā)表文獻(xiàn)約4000多篇，較2019年發(fā)表數(shù)量增長(zhǎng)27%;在藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，相比于細(xì)胞療法，外泌體治療*的優(yōu)勢(shì)為當(dāng)前一些難治疾病的治療或者難以成藥靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)帶來(lái)一些新的機(jī)會(huì)。

　　一方面，外泌體代替細(xì)胞治療，避免了細(xì)胞治療帶來(lái)的免疫排斥和致瘤爭(zhēng)議;另一方面，外泌體膜表面組織特異性抗原的表達(dá)為器官、組織、細(xì)胞靶向性的藥物開(kāi)發(fā)提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。復(fù)雜的膜組分可以讓外泌體通過(guò)表面的蛋白相互作用，或者進(jìn)入靶細(xì)胞來(lái)發(fā)揮作用，這使得藥物的作用方式更加多元化。另外，外泌體的免疫原性很低，可以重復(fù)給藥，且外泌體可以無(wú)創(chuàng)性地通過(guò)許多組織屏障(例如血腦屏障等)。

　　隨著外泌體研究與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的日益火爆，外泌體需求與日俱增。除了依靠自己制備之外，市場(chǎng)上提供外泌體制備服務(wù)的公司也如雨后春筍般不斷涌現(xiàn)。如何獲取一款適合自己應(yīng)用所需且純度高的外泌體就成了一道難題。以下，就如何選擇適合自己的可靠外泌體談?wù)剛€(gè)人看法。

　　一、看外泌體來(lái)源

　　要根據(jù)個(gè)人研究或使用需求選擇合適來(lái)源的外泌體。

　　外泌體的細(xì)胞來(lái)源非常之廣泛，包括幾乎所有種類(lèi)的細(xì)胞都會(huì)分泌外泌體，但不同來(lái)源的外泌體具有不同功能。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體也具備了很多間充質(zhì)干細(xì)胞的功能，比如血管新生、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)功能等;神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可能更能促進(jìn)神經(jīng)再生;而腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體則在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)過(guò)程起著重要作用。我們可以根據(jù)自己的應(yīng)用方向和需求選擇合適的外泌體來(lái)源。

　　二、看外泌體純化方式

　　外泌體的提取方法有多種：包括傳統(tǒng)的差速離心、密度梯度離心，以及后來(lái)發(fā)展的超濾法、聚合物沉淀法、免疫分離、隔離篩選法、體積排阻色譜法等。這些方法各有利弊。

　　外泌體純化的方式多種多樣，目前存在的主流方式主要包括超速離心法、基于PEG-base沉淀法開(kāi)發(fā)的試劑盒提取方式、磁珠免疫法、超濾離心法等等。這幾種外泌體提取的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。下圖是試劑盒提取外泌體以及超速離心提取的外泌體幾種指標(biāo)的鑒定比較。

　　超速離心是從生物體液或細(xì)胞上清分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)方法。采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。目前在國(guó)外的重要期刊如Cell、Nature、Science以及其眾多子刊中，超速離心是普遍應(yīng)用的經(jīng)典技術(shù)手段。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超速離心獲取的外泌體純度更高，均一性更好，具有更小的粒徑，但相對(duì)于PEG-base沉淀法，超速離心法的產(chǎn)量不高。二者都是實(shí)驗(yàn)室常用的外泌體提取方法，小編認(rèn)為，我們可以根據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)或應(yīng)用的需求選擇相應(yīng)的方法，例如對(duì)于分子機(jī)制研究或載體的應(yīng)用，建議使用超離法提取外泌體，獲取更高純度的外泌體，以減少雜質(zhì)對(duì)應(yīng)用結(jié)果的干擾。

　　四、外泌體三大質(zhì)檢驗(yàn)證，符合鑒定“金標(biāo)準(zhǔn)”

　　外泌體經(jīng)細(xì)胞分泌后存在于體液或者血液中，故外泌體的制備與提取一般為血液（全血、血漿）、體液（尿液、唾液、腦脊液、羊水、唾液等）、細(xì)胞上清液。

　　國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)于2014年發(fā)布的一個(gè)指導(dǎo)性聲明文件，文件指出了目前研究和定義細(xì)胞外囊泡及其功能所需要的最少實(shí)驗(yàn)要求。這個(gè)聲明文件發(fā)表在《細(xì)胞外囊泡雜志》上。目前該聲明正在籌劃更新。

　　據(jù)國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）在2014年的提議，外泌體鑒定分為三個(gè)層面：透射電鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）、Nanosight粒徑、蛋白標(biāo)志物。

　　NTA粒徑分析

　　納米顆粒跟蹤分析（NanoparticleTrackingAnalysis,NTA）是對(duì)每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行追蹤和分析，結(jié)合Stockes-Einstein方程式計(jì)算出納米顆粒的流體力學(xué)直徑和濃度，檢測(cè)10nm–1000nm范圍內(nèi)的顆粒。NTA技術(shù)已被外泌體研究領(lǐng)域認(rèn)可為外泌體表征手段之一；相較于其他表征方式，NTA技術(shù)的樣本處理更簡(jiǎn)單、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測(cè)速度更快。

　　外泌體電鏡分析

　　雙層囊膜結(jié)構(gòu)（茶托狀）是外泌體重要標(biāo)志之一，但普通光學(xué)顯微鏡難以觀(guān)察到此種亞顯微結(jié)構(gòu)。而透射電子顯微鏡(Transmissionelectronmicroscope,TEM)分辨率可達(dá)0.1-0.2nm，可將被觀(guān)察物體放大至數(shù)百萬(wàn)倍，是外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀(guān)測(cè)的經(jīng)典方法。

　　外泌體標(biāo)志物鑒定

　　通過(guò)對(duì)經(jīng)典文獻(xiàn)中普遍采用的抗體進(jìn)行驗(yàn)證和挑選，優(yōu)選了多種外泌體標(biāo)志物抗體，如CD9、CD63、CD81、HSP70、TSG101、Alix等。

　　五、外泌體的保存及運(yùn)送

　　外泌體應(yīng)低溫保存；短時(shí)間（一般1周以?xún)?nèi)）可放4℃，長(zhǎng)時(shí)間可放-20℃或者-80℃，并避免反復(fù)凍融。